檢測方法
利用酶聯免疫吸附測定法用食品及飼料中三聚氰胺的定量測定。
檢測原理
酶聯免疫吸附測定法定（dìng）量測定三聚氰胺（àn）殘留。利用萃取（qǔ）液通過均質及振蕩的（de）方式提取樣品中的三聚氰胺進行免疫測定。先將三聚氰胺酶標記物，樣品萃取物及標準加入到已經包被有三聚氰胺（àn）抗體的微孔中開始反應。在30分鍾的孵育過程中，樣品萃取物中的三聚氰胺與三聚氰胺酶標記物競爭結合微孔中的三聚氰胺抗體，孵育30分鍾後洗掉小孔中所有沒有（yǒu）結合（hé）的三聚氰胺及三聚氰胺酶標記物。在用（yòng）去離（lí）子水清洗結束後，每孔中加（jiā）入清澈的底物溶液，結合的酶（méi）標記物將無色（sè）的底物轉化為藍色的物質。孵育30分鍾後（hòu）停止此反應，根據各孔顏色（sè）深（shēn）淺進行（háng）數（shù）據讀取。依據標準的顏色得出樣品中三聚氰胺（àn）的（de）的濃度值。
實驗所需設備及材料
三聚氰胺檢測試劑盒（目前（qián）常用進口（kǒu）試劑有美國Abraxis公司和美國Beacon公（gōng）司的）
酶標儀一（yī）台（配（pèi）有450nm濾光片）
1－5ml可調移液器
100－1000ul可調（diào）移液（yè）器.
20－200ul可調移液器（qì）.
蒸（zhēng）餾水或（huò）去離子（zǐ）水..
可吸取50ul的移液器及吸（xī）頭.
可吸（xī）取50ul和100ul的八道移液器及吸頭.
吸水紙或相當的吸水材料.
450nm的酶標儀.
計時器（qì）.
洗瓶（píng）
混旋器.
20mM PBS： 0.62g NaH2PO4-2H2O+5.73gNa2HPO4-12H2O+9gNaCl ,蒸餾水定容至1000ml.
注意事項
最好配套使（shǐ）用試劑，不（bú）要同其它（tā）公（gōng）司的產品混用，不（bú）要將（jiāng）不同批次的產品混用。
樣（yàng）品稀釋或含有雜質很（hěn）可能對結果的準（zhǔn）確性有影響。
不要使用過期的產品。
使用之前將所有試劑回升（shēng）至室溫，但不要放置（zhì）超過24小時。
三聚氰胺屬於有毒性的化學品，請小心處理。
停止（zhǐ）液是1N鹽酸（suān），避免（miǎn）接觸皮膚。
樣品製（zhì）備 （以美國Beacon試（shì）劑為例）
濕的寵物食品萃取方法（稀釋倍數：100）
均質（zhì）樣品至布丁狀。
稱取2g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液，並劇（jù）烈振蕩。
超聲萃取1分鍾。
漩渦混合1分鍾（zhōng），然後靜置（zhì）5分鍾，使樣品分層。
3000 g 室溫離心5分鍾。
用玻璃纖維濾紙過（guò）濾上清液，並將萃取液收集於一幹（gàn）淨試管中（zhōng）。
用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾（lǜ）液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
移取150 ul 進（jìn）行分析。
注意：用此（cǐ）方法測定了8個添加有15ppm三聚氰胺的（de）貓（māo）糧（非要求召回），回收（shōu）率範（fàn）圍為75%-117%。
本方法隻可作為樣（yàng）品篩選方法，不可作為最終確認方法。
小麥麵筋蛋白萃取方法：（稀釋倍數：500）
1.均質或混勻（yún）小（xiǎo）麥麵筋蛋白樣品。
2.稱取0.2g均質好的（de）樣品加（jiā）入10mL 酸化的60%甲醇/水溶液(1mL 1N HCl/ 100mL 60%甲醇/水)。
3.漩渦混（hún）合並超聲（shēng）萃取，使樣品溶解（確（què）保樣品中沒有結塊）。
4.用樣品（pǐn）稀釋液稀釋萃取液按照1:10比例。（0.5mL+4.5mL 10%MeOH/20 mM PBS）。
5.10000轉/分離心上清液10分鍾。
6.用（yòng）G6玻璃纖維濾紙過濾上清（qīng）液，並（bìng）將（jiāng）萃取液（yè）收集於（yú）一幹淨試管中。
7.移取（qǔ）150 ul 進行分析。
注意（yì）：如果（guǒ）樣品中含（hán）有大量的（de）添加物，需要加入更大（dà）量的萃（cuì）取溶液，以保（bǎo）證萃（cuì）取效率。
操作人（rén）依（yī）據（jù）自己的判斷力，如果測試結果比較高，需要加入（rù）兩倍的萃取溶液（0.2/20mL），進（jìn）行二次測定。
幹的寵物食品萃（cuì）取方法（稀釋倍（bèi）數：200）
1.質器均質幹的寵物飼料樣品。
2.稱取（qǔ）1g樣品加入10mL 60%甲醇/水溶液，並劇烈振蕩。
3.超聲萃取1分鍾。漩渦混合1分鍾，然後靜置5分鍾，使樣品分層。
4.3000 g 室溫離心5分鍾。
5.用G6玻璃纖維濾紙過（guò）濾上清液（yè），並（bìng）將萃（cuì）取液收集於一幹淨試管中（zhōng）。
6.用樣品稀釋液將濾液20倍稀釋（如：0.1mL濾液+1.9mL 10%甲醇/20mMPBS）
7.移取150 ul 進行分析（xī）。
免疫測定過程 (注意（yì）: 標準及樣品最好做平行試驗以增加準確度)
將所有試劑及樣品回升至室溫20-280C，但不要放（fàng）置超過24小時。
從鋁箔袋中拿出要求數量的微孔條，放入幹燥劑並重新封（fēng）好袋子以免微孔條（tiáo）受潮
吸取150ul標準、樣品到對應微孔中，必須保證每種溶液使用幹淨的吸頭吸（xī）取，避（bì）免交（jiāo）叉汙（wū）染。 加入50ul三（sān）聚氰胺酶標記溶液（yè）到（dào）每個小孔中。
混合（hé）60秒，20-28攝氏度（dù）下孵育30分鍾。
將微（wēi）孔中的溶液倒入水（shuǐ）槽中，用蒸餾水完全充滿微孔，震蕩後倒掉，重複（fù）三次，總共四次洗板。
在吸水紙上拍打，盡可能將水拍幹。
每個微孔（kǒng）中加入100ul底物溶液。
20-28攝氏度下，孵育30分鍾（zhōng）。
每個微孔中加入（rù）100ul停（tíng）止液。
450nm下讀板。
結果分析
半（bàn）定量的結果是由樣品的吸光率與標準的吸光率的簡單（dān）對比而來判定:樣品的（de）顏色比（bǐ）標準的顏色淺則三聚氰胺的濃（nóng）度比標準樣的濃度高, 樣品的顏色比標準的顏色深則三聚氰胺的濃（nóng）度比標準樣的濃（nóng）度低。
定量分析需要繪製以標準樣的吸光率（lǜ）為X軸,以標準樣的濃度的半對數為Y軸的曲線圖.依據標準樣吸光率的點畫成一直線,如此樣品的光吸收率可在線上找到,與此相對應的Y軸則為樣品的濃度,樣品光吸收率範圍應比標準（zhǔn）樣的（de）最底範圍（wéi）高,比最高範圍低, 即可說明此樣（yàng）品中三聚氰胺的（de）含量大於500ppb或小於20ppb。